Las transcripasas inversas de los virus, como las presentes en el Virus de la Leucemia Murina Moloney, son utilizadas en biología molecular para la aplicación de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) . Su importancia reside en que es un método para la detección molecular de genes, también en la cuantificación de la expresión génica (se necesita pasar el RNAm producido por los organismos muestra a DNA para poder amplificarlo en la PCR). Además el  ADNc generado por la transcriptasa del VLM Moloney, ya no lleva intrones que sí tendría el ADN original. De este modo, al expresar el ADNc producto de la RT-PCR, se generará un ARNm formado exclusivamente por exones. Esto ha permitido darle a esta técnica uno de sus usos más importantes: insertar genes eucariotas en organismos procariotas.

¿En que se basa el proceso?

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa  (Reverse transcription polymerase chain reaction) es una variante de PCR, técnica para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso llamado «amplificación». En la RT-PCR, sin embargo, una hebra de ARN es retrotranscrita en ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa inversa, y el resultado, se amplifica en una PCR tradicional. La amplificación exponencial mediante PCR en Transcripción Reversa supone una técnica altamente sensible, que puede detectar un número de copias de ARN muy bajo. 

En el siguiente esquema se observa con más claridad:

 «La alegría de cuantificar genes»

La transcriptasa inversa, o también conocida como DNA polimerasa transcripasa inversa es una enzima DNA polimerasa que transcribe una sola cadena de RNA en una sola cadena de DNA. También ayuda en la formación de una doble hélice de DNA una vez que el RNA ha experimentado una transcripción inversa en una sola cadena de DNAc.

Función:

Es una enzima del retrovirus, pero no exclusiva de este, que le permite transformar su RNA en el DNA de la célula con el objetivo de integrar su material hereditario al de la célula, para lograr que cuando ésta replique, en su etapa temprana, «viriones». Gracias a esta característica los retrovirus son capaces de fabricar una copia de DNA.

Como lo hace: 

La transcriptasa inversa es capaz de catalizar el enlace de los nucleótidos libres e introducirlos en una cadena de DNA complementario (DNAc) en un molde o plantilla de RNA mensajero (RNAm). Los pares de bases de DNAc se enlazan con puentes de hidrógeno a las de RNAm, dando origen a una molécula híbrida. A continuación se agrega RNA polimerasa a la mezcla. Separa las bases de RNA de la molécula híbrida mientras copia la primera cadena de DNAc en una segunda cadena. El resultado es una copia de DNA de cadena doble al RNA original. Las enzimas transcriptasa inversa incluyen un RNA polimerasa de DNA dependiente y un DNA polimerasa dependiente de DNA, que trabajan juntos para llevar a cabo la transcripción.

La transcripción inversa es la conversión del RNA de cadena simple, sirviendo este como molde, a DNA de doble o simple cadena. La realización del proceso es mediada por proteínas estructurales de la cápside y/o enzimas como la transcriptasa inversa.

El fundamento molecular de la retrotranscripción en retrovirus implica la conversión de dos RNAs de cadena simple con sentido positivo en una molécula de DNA ligeramente más larga que el RNA original, debido a la repetición directa de las secuencias vecinas a los fragmentos originales, llamados long terminal repetats (LTRs).

Dos grupos de virus pertenecientes a la familia Retroviridae utilizan la transcripción inversa para replicarse:

• Virus DNA bicatenario retrotranscrito: son pertenecientes los Hepadnaviridae, como los virus de la Hepatitis.
• Virus de RNA monocatenario retrotranscrito: se encuentran los Retrovirus como el virus del VIH.

Proceso de transcripción:

1. Un tRNA específico celular actúa como un cebador (primer) y se mezcla en la parte complementaria del genoma del virus, llamado sitio de unión del primer o PBS.

2. El DNA complementario de une a la U5, región no codificante, y a la región R del RNA viral, una repetición directa que se encuentra en ambos extremos de la molécula de RNA.

3. Un dominio de la enzima transcriptasa inversa llamada RNAsa H degrada el extremo 5′ del RNA que elimina la U5 y la región R.

4. A continuación el primer «salta» al extremo 3′ del genoma viral y las hebras de DNA recién sintetizado híbrida con la región R complementarias en el RNA.

5. La primera hebra de DNA complementario (DNAc) es extendida y la mayoría de RNA viral es degradado por la RNAsa H.

6. Una vez que la cadena se completa, la síntesis de la segunda hebra se inicia desde el RNA viral.

7. Hay otro «salto» en el PBS de la segunda cadena, este se mezcla con el PBS complementario de la primera hebra.

8. Ambas corrientes se extienden más allá y pueden incorporarse al genoma del huésped gracias a la enzima integrasa.

También se encuentran en procariotas (ámbito también perteneciente a la microbiología). Las transcriptasas inversas también se encuentran en las bacterias Retron msr RNAs, presentan distintas secuencias que codifican para la transcriptasa inversa, y se utilizan en la síntesis de msDNA. Con el fin de iniciar la síntesis de DNA, se necesita un primer (como hemos visto en el apartado anterior), que en bacterias se sintetiza durante la replicación.

1. Terapia génica: partículas derivadas de los VLM pueden suministrar genes terapéuticos a las células diana.

2. Estudios sobre el cáncer: se utilizan para estudiar el desarrollo del cáncer.

3. Retrovirus modelo: en estudios para la obtención de información teórica viral.

4. Transcriptasa inversa: utilizada en biotecnología.

5. Modelos murinos de enfermedades humanas.

6. Terapia génica de células en reposo.

Replicación de un retrovirus típico

Los retrovirus adquirieron su nombre cuando en 1970 se descubrió la transcriptasa inversa (RNA dependiente de DNA polimerasa) y se demostró que sus genomas de ARN se copian en DNA. Este ARN a la conversión de ADN era el primer ejemplo de una dirección «hacia atrás» de la información genética en los sistemas biológicos. No temais, pese a este pequeño inconveniente también se pudieron sintetizar retrovirales con una pequeña modificación se incorporan selectivamente como terminadores de cadena de ADN por la transcriptasa inversa viral y no por las polimerasas de ADN del huésped. Investigaciones recientes confirman un elevado grupo de elementos genéticos que son retrotranscritos en algún momento de la replicación, más de los que se pensaba al descubrir este grupo incluyendo los retrotransposones de eucariotas (Si como ois ¡retrotranscripción en eucariotas!). Para que os hagais una idea más clara, ahí va una versión simplificada del ciclo de replicación de un retrovirus:

La partícula de virus es diploide, es decir, que lleva dos copias del genoma en su núcleo. La transcriptasa inversa también está empaquetada en el núcleo pero no se activa enzimáticamente hasta que la penetración. Los cebadores para la transcripción inversa son moléculas de RNA de transferencia celulares que hibridan con el genoma del RNA viral y a partir de estos cebadores se forman las cadenas de DNA. La transcriptasa inversa también tiene una actividad RNAsa que elimina el RNA parental a partir del DNA, que entonces forma el molde para la síntesis de la segunda cadena de DNA, así se forma una doble hebra DNA «provirus». Este provirus es haploide pero tiene secuencias derivadas de las dos cadenas de RNA mediante un mecanismo de elección de copia se proporciona repeticiones terminales largas (LTR) en cada extremo del genoma de DNA (Skalka y Goff, 1993). El provirus a continuación se integra en el DNA cromosómico del huésped, catalizado por otra enzima viral, la integrasa.  La integración no es específica de lugar pero se produce preferiblemente en eucromatina. Una vez integrado, el virus, puede permanecer latente y más tarde replicarse junto con el resto del DNA del huésped, si la célula infectada está proliferando.

La expresión del provirus proporciona RNAm para la traducción a proteínas virales y las transcripciones de longitud completa proporcionan RNA genómico para el envasado de viriones. El control de la transcripción del RNA viral del provirus a DNA integrado, depende de reguladores transcripcionales celulares. Los retrovirus complejos también requieren proteínas reguladoras virales tales como la tat para una eficiente transcripción del RNA y la rev que ayuda al transporte de los transcritos virales más grandes en el paso del núcleo al citoplasma. El la maduración del virión las proteínas del núcleo y de la matriz se forman a partir de la proteína gag, precursora que se escinde por la proteasa viral en una etapa tardía del virión. 

Las glicoproteïnas de la envoltura transmembrana gp41 (TM) y las de superficie gl120 (SU), se sintetizan en el retículo endoplasmático rugoso y son escindidos por enzimas tipo furina durante el procesamiento a través del aparato de Golgi a la superficie celular, en el que se incorporan en ciernes los viriones.

Detalles de la replicación en los VLM

La replicación de los virus de la leucemia murina funcionan a modo de retrovirus de tipo C. Producen un virión que contiene una nucleocápside esférica que contiene el genoma viral junto al complejo con proteínas virales, rodeada por una bicapa lipídica derivada de la membrana de la célula huésped. La bicapa lipídica contiene integradas proteínas del huésped y víricas junto moléculas de carbohidratos. La partícula viral es de aproximadamente 90 nanómetros (nm) de diámetro.

Els VLM replican sus genomas con una fidelidad relativa muy baja. De este modo las secuencias virales son divergentes, quizás únicas en un solo organismo huésped. La transcriptasa inversa tiene una fidelidad de replicación  ligeramente más alta que la del VIH-1.

Genoma

Los genomas de los virus de la leucemia murina son exógenos y endógenos, han sido completamente secuenciados. El genoma viral es una sola hebra, lineal de sentido positivo, constituido por una molécula de ARN de alrededor de 800 nucleótidos. A partir de 5′ a 3′, el genoma contiene gag, pol y regiones env, que codifican para las proteínas estructurales, enzimas incluyendo la polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa inversa, ya muy mencionada) y de las proteínas acompañantes respectivamente. La molécula genómica contiene en 5′ la estructura de capucha metilada y en 3′ la cola de poliadenosina.

Los genes secuenaciados del VLM se pueden encontrar en la web del National Center for Biotechnology information. NCBI. A este centro de investigación pertenece una de las bases de datos genéticos más grandes actualmente.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/  (NCBI web)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?LinkName=genome_gene&from_uid=10291 (Secuencias VLM)

El genoma incluye elementos estructurales conservados, llamados señales de encapsulación, que empaquetan directamente el RNA dentro del virión. La estructura terciaria de este elemento ha sido encontrada mediante espectroscopia nuclear magnética.

Los virus de la leucemia murina (MLV ) o MuLVs son retrovirus llamados así por su capacidad de causar cáncer en sus huéspedes, los murinos (subfamilia de roedores). Algunos MLV pueden infectar a otros vertebrados. En dicha categoría se incluyen tanto los virus exógenos que se trasmiten como nuevas infecciones de un huésped a otro, y como endógenos, integrados en la línea germinal del anfitrión y que se transmiten de una generación a la siguiente. 

Una de las curiosidades de este virus es la bioquímica de su material genético, cuando estos no están infectando, se basan en el RNA como molécula para almacenar su información génica (al contrario que la mayoría de los organismos conocidos que utilizan el ADN). A estos extraños «organismos» se les llama retrovirus. Entonces, ¿Que polimerasas utilizan en la replicación? Como sabréis las polimerasas son las proteínas encargadas de llevar a cabo la transcripción, el paso de DNA a RNA. En este caso en particular el RNA inicial se codifica a ADN (¡al revés!) mediante una polimerasa reversa, en el proceso de la transcripción inversa. Una vez el virus tiene su material basado en desoxirribonucleótidos (DNA) realiza de nuevo la transcripción a RNA, ya esta listo para infectar y/o traducir. También comentaros que su RNA es de cadena senzilla (ssRNA).

Para los más curiosos…

Además de transcribir, los virus han de replicarse (MVL lo hace en sentido positivo) quieren hacer más réplicas de si mismos. Para poder realizarlo infectan a su huésped, en este caso un murino, y aprovechan sus maquinarias celulares. Los ciclos reproductivos de los virus pueden ser líticos o lisogénicos.

Los virus de la leucemia de múridos pertenecen al grupo / tipo VI que pertenece al género gammaretroviral de la familia Retroviridae. Las partículas virales de replicación MLVs tienen morfología de tipo C, como se determina por microscopia electrónica. Existen diferentes cepas del virus como el Moloney, Rauscher, Abelson y Friend MLVs, llamados así por sus descubridores, de gran importancia ya que se utilizan en la investigación del cáncer.

Stoye y Ataúd los han clasificado en cuatro categorías por la especificidad del hospedador, determinada por la secuencia genómica que codifica la región de la cubierta:

• MLVs ecotrópicos (ecotropic de eco, «casa»), son capaces de infectar células de ratón en cultivo.
• MLVs no-ecotrópicos, pueden ser xenotrópicos (de xeno, «extranjero») infectando a las especies no murínicas.
• MLVs politrópicos modificados, pueden infectar a una serie de hospedadores incluyendo ratones. Diferentes cepas de ratones pueden albergar diversos números de  retrovirus endógenos, por lo tanto los nuevos virus pueden surgir como resultado de la recombinación de secuencias endógenas.

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Volviendo al tema (virus, virus, virus…) Las siguientes entradas estarán dedicadas al descubrimiento, estructura, bioquímica y utilidad del virus de la leucemia murina. ¿Por qué el virus de la leucemia murina? Veréis quería escoger un virus basado en el RNA concretamente porqué sus polimerasas reversas son las segundas más utilizadas en la transcripción inversa (las primeras las posee el virus del VIH), proceso indispensable actualmente en  biología molecular. A su vez, como explicaré más adelante, es un virus que implica patologías en roedores, muy estudiadas en campos como la neurobiología.

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